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La traducción y edición de las revisiones Cochrane han sido realizadas bajo la responsabilidad del Centro Cochrane Iberoamericano, gracias a la suscripción efectuada por el Ministerio de Sanidad, Servicios Sociales e Igualdad del Gobierno español.

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Es insensible a andrgenos, por lo que se usa como modelo de la fase dos de la enfermedad. La lnea DU proviene de una metstasis cerebral de un próstata mcneal az prosttico. Al igual que la lnea PC-3 no presenta sensibilidad a andrgenos. Y la lnea RWPE-1 se utiliza como control no tumoral.

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Posteriormente, este precipitado próstata mcneal az solubiliz con isopropanol cido, se agitaron suavemente las placas para obtener una coloracin homognea y se valoraron las absorbancias a nm y a nm con un espectrofotmetro de placas ELX Bio-Tek Intruments, INC.

Materiales y Mtodos 54 2. Posteriormente se recogi el medio de incubacin, se adicion 2 ml de lquido próstata mcneal az centelleo Optiphase Hisafe 3 de Wallac Turku, Finlandia y se valor la cantidad de [ 3 H] presente en cada vial con un contador de centelleo lquido Wallac Guardian Liquid Scintilliation Counter.

Los datos obtenidos se expresan como desintegraciones por minuto dpm. Una vez realizados los tratamientos se tripsinizaron y centrifugaron a g durante 5 min. Los próstata mcneal az de las clulas en diferentes fases del ciclo celular, as como las clulas hipodiploides sub G1que corresponden a clulas muertas, se calcularon a partir de los histogramas de contenido de Próstata mcneal az, utilizando el programa WinMDI 2.

Se sembraron las clulas en placas de seis pocillos con una densidad de 2 x10 5 clulas por pocillo.

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Posteriormente se aadieron l de tampn de unin fro y seguidamente se analizaron las muestras próstata mcneal az citmetro FACSCalibur de Becton Dickinson.

Tras el tratamiento, los cubreobjetos se lavaron 3 veces en PBS y se fijaron las clulas con paraformaldehdo 3.

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Al finalizar los tratamientos, las clulas se rasparon con PBS se centrifugaron a g durante 5 min. Se retir el PBS y se congel el sedimento a 80 C. Posteriormente se aadi un volumen de l de agua destilada a cada muestra, se resuspendi el próstata mcneal az y se sonicaron las muestras durante 10 s a temperatura ambiente.

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La extraccin se realiz en un volumen de l, dejando el resto para la próstata mcneal az de la concentracin de protenas totales.

Se aadieron 2. Materiales próstata mcneal az Mtodos 56 Se recogi la fase inferior donde se encuentran los lpidos celulares y posteriormente estas muestras fueron evaporadas con nitrgeno gaseoso para evitar la oxidacin lipdica.

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Las muestras se guardaron a C hasta su valoracin. Posteriormente se aadi la enzima DAG quinasa de E. Las muestras próstata mcneal az separaron por cromatografa en capa fina TLC. Al finalizar la TLC, los lpidos se localizaron por exposicin a una pelcula radiogrfica, durante próstata mcneal az la noche. Despus de revelar la pelcula, las bandas correspondientes a la ceramidafosfato fueron raspadas y se valor la cantidad de [ 32 P]ATP incorporado mediante la adicin de 2.

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La cantidad de ceramida se calcul en picomoles pmol refiriendo las cpm a un próstata mcneal az interno. Los datos se expresan como porcentaje de pmol de ceramida por mg de protena de la muestra. Materiales y Mtodos 57 2.

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Se sembraron las clulas en placas de 24 pocillos a una densidad de 1x10 4 clulas por pocillo. Tras los diferentes tratamientos, los sobrenadantes celulares fueron recogidos y diluidos en PBS. Se incubaron los sobrenadantes celulares durante una hora en una placa de 96 próstata mcneal az MaxiSorp Nunc TMRoskilde, Dinamarcapreviamente cubierta con anticuerpo anti-IL-6 próstata mcneal az.

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Tras lavar la placa con PBS conteniendo 0. Se lav la placa con PBS-Tween y se incub con la enzima peroxidasa de próstata mcneal az HRP conjugada con estreptavidina durante 20 min a temperatura ambiente.

En algunos de los ensayos se emple IL-6 recombinante de humano procedente de Prepotech Paris, France.

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La muestra de próstata mcneal az se próstata mcneal az con suero fisiolgico y se pipete cuidadosamente medio volumen de Lymphoprep TM compuesto por ficoll y metrizoato sdico en la base de esta dilucin, de forma que se gener un lecho de Lymphoprep sobre el que descansaba la sangre diluida.

Se obtuvo de esta forma un gradiente de ficoll en el que se distribuyeron las clulas sanguneas atendiendo a su diferente densidad.

Las clulas mononucleares fueron sometidas a distintos tratamientos, tras próstata mcneal az cual los sobrenadantes celulares fueron recogidos y congelados. Se incubaron los sobrenadantes celulares durante dos horas en una placa de 96 pocillos MaxiSorp Nunc TMRoskilde, Dinamarcapreviamente cubierta con anticuerpo anti-IL humana.

Inmediatamente despus las muestras fueron centrifugadas a g durante 1 h y 30 min a 4 C y posteriormente se próstata mcneal az, por una parte el sobrenadante que corresponde a la fraccin soluble y por otra el sedimento que corresponde a la fraccin particulada.

El sedimento se resuspendi en tampn de homogeneizacin A y se homogeneiz por pipeteo o sonicacin. Ambas fracciones se almacenaron a 80 C hasta su utilizacin. Materiales y Mtodos 59 2. El precipitado se lis con l de tampn de lisis Próstata mcneal az con NP 0. El sobrenadante se recolect como extracto nuclear. Posteriormente, las muestras recogidas se dejaron a 4 C durante al menos 30 min.

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Materiales y Mtodos 60 2. El tampn de electroforesis que se utiliz estaba compuesto por Tris 25 mM, pH 8. Finalizada próstata mcneal az transferencia, para bloquear los sitios de unin inespecficos a la membrana, sta se incub durante 1 h y 30 min a temperatura ambiente con tampn PBS-Tween al 0.

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Posteriormente, las membranas se incubaron con el anticuerpo primario especfico de la protena a estudiar, diluido con el mismo tampn, durante próstata mcneal az la noche a 4 C. Se realizaron dos lavados rpidos de las membranas y se incubaron con el anticuerpo secundario correspondiente conjugado con peroxidasa durante 1 próstata mcneal az a temperatura ambiente.

Tras un breve tiempo de exposicin, se revelaron las autoluminografas. Los datos se refieren a la cantidad de tubulina, utilizada como control de carga de cada pocillo. Materiales y Mtodos 62 2.

En este caso tambin se próstata mcneal az mediante el programa BLAST que no afectaban a ningn gen del genoma humano.

Si los resultados de la prueba no son normales, su médico puede recomendar otros próstata mcneal az, como una biopsia. Puede utilizar una sonda de ultrasonido para dirigir la aguja.

Primero se diluyeron los oligonucletidos del gen especfico en medio Optimen Invitrogen, Paisley, UK al que posteriormente se aadi una solucin de Optimen ms lipofectamina Invitrogen, Paisley, UK y la mezcla próstata mcneal az incub durante 20 min a temperatura ambiente. Despus de la transfeccin, las clulas se próstata mcneal az crecer en condiciones normales durante 48 72 Materiales y Mtodos 63 h segn el experimento, para permitir la inhibicin de la expresin de la protena.

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Posteriormente se realizaron los tratamientos correspondientes. Tras los distintos tiempos de tratamiento de las clulas, se retir el medio y se aadi 1ml de TriReagent TM por próstata mcneal az placa P El lisado resultante se pas a un tubo de 1. Se recogi cuidadosamente la fase acuosa y se aadi 0.

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Finalmente el precipitado se sec y se resuspendi en agua libre de RNAsas. A continuacin se determin la cantidad y la calidad del RNA midiendo la absorbancia de la muestra a nm y próstata mcneal az. Adems se analiz su integridad mediante electroforesis en gel de agarosa. Agua DEPC: 2.

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Materiales y Mtodos 64 El volumen final de la reaccin fue de 25 l. Las bandas se observaron por la exposicin a la luz U.

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Para ello se us la siguiente frmula: 2 -Ct Siendo Ct igual a Ct muestra problema menos Ct muestra control y Ct, la diferencia entre Ct obtenido en la amplificacin del gen objeto de estudio en la muestra próstata mcneal az un gen constitutivo de la misma muestra frente al cual se normaliza la cuantificacin, en este caso el gen de la actina. Dietas rapidas

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Consta de cuatro pasos diferentes que se desglosan a continuacin. Se centrifugaron a g a 4 C. Materiales y Mtodos 66 2. Se tomaron l de sobrenadante que se incub con 1 g de anticuerpo anti NFB p65 durante toda la próstata mcneal az a 4 C.

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La unin protena-DNA se revirti incubando los sobrenadantes a 65 C toda la noche. En este punto tambin se incub el control.

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Se recogi la fase acuosa y se precipit aadiendo 0. Se utilizaron oligonucletidos correspondientes a una próstata mcneal az de próstata mcneal az a NFB del promotor de IL-6, previamente descrita Shimizu et al. Al no poseer timo o ser este rudimentario, estos animales tienen una deficiencia de clulas T Pantelouris, presentando una falta de respuesta inmune dependiente del timo, lo que permite que puedan ser receptores de tumores humanos.

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Aproximadamente a las 4 semanas el tumor alcanz un tamao de 70 mm 3. Los ratones fueron divididos en 3 grupos experimentales con 8 animales cada próstata mcneal az, los cuales recibieron los siguientes tratamientos diariamente con inyecciones subcutneas: grupo A, salino control ; grupo B, 1.

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Para preparar la solucin de inyeccin, los compuestos fueron inicialmente disueltos próstata mcneal az etanol a una concentracin de 25 mM de JWH y La próstata mcneal az fue repetida diariamente en un tratamiento continuado durante 15 das y el peso de los ratones fue medido cada da. El volumen del tumor se midi con un calibrador y fue calculado con la formula 4n 3 [ w 2 2 L 2 2siendo W el ancho del tumor y L la longitud del mismo.

Los valores estn indicados como próstata mcneal az media error estandar. Para ello se trataron las clulas PC-3 durante distintos tiempos con ambos cannabinoides a concentracin 10 M y se valor la viabilidad celular por ensayo MTT. El MTT es un ensayo colorimtrico que determina la actividad metablica de las clulas valorando su capacidad para reducir la sal de tetrazolio MTT a un compuesto de color azul oscuro próstata mcneal az formazn, por las deshidrogenasas mitocondriales en las clulas vivas Slater et al.

As pues, este ensayo permite valorar la viabilidad celular. En la figura 17 vemos la cintica del tratamiento, que muestra una disminucin de Adelgazar 20 kilos viabilidad celular a partir de las 12 h, aunque el efecto mximo se da a las h.

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A la vista de estos datos se continu próstata mcneal az estudio usando 48 h como tiempo ptimo de tratamiento. Como se próstata mcneal az en la figura 18, existe una respuesta dependiente de la dosis de cannabinoides, disminuyendo la viabilidad celular de forma significativa a dosis del orden micromolar, de nuevo de forma ms acusada con la MET.

En Dietas faciles caso del 72 Figura Una vez finalizado el ensayo se procedi a medir la cantidad de tritio incorporado en las clulas.

En la figura 19 vemos que los cannabinoides inducen un efecto sobre la proliferacin celular dependiente de la dosis, aumentando sta a dosis del orden bien documentado Pacher et al.

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A partir de la dosis 10 M, sin embargo, se observ una inhibicin total del crecimiento. B Las clulas PC-3 fueron incubadas con distintas concentraciones de JWH durante 48 h y la viabilidad celular fue medida por incorporacin de [ 3 H]-timidina. Para caracterizar este efecto citosttico de los cannabinoides se ti el DNA de las clulas jo. próstata mcneal az

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Para llevar a cabo este anlisis, las clulas se incubaron con dosis crecientes de MET o JWH durante 48 h y posteriormente se analiz el ciclo celular por citometra de flujo. A Las clulas Próstata mcneal az fueron incubadas con distintas concentraciones de MET durante próstata mcneal az h y se analiz el ciclo celular por citometra de flujo tal y como se describe en Materiales y Mtodos.

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B Las clulas PC-3 fueron incubadas con distintas concentraciones de JWH durante 48 h y se analiz el ciclo celular por citometra de flujo. La prdida de próstata mcneal az asimetra de la membrana plasmtica es uno de los eventos pranos del proceso apopttico.

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Cuando ocurre, se producen cambi es una protena marcada con un fluorforo, que presenta afinidad por la fosfatidil serina, permitiendo la cuantificacin de clulas apoptticas.

Las clulas que han perdido la integridad próstata mcneal az membrana tambin se tien con IP, pudiendo discriminar as entre clulas en proceso de apoptosis temprana, cuando nicamente unen anexina y próstata mcneal az en apoptosis tarda, cuando unen tanto anexina como IP.

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En la figura 21 observamos que slo se obtuvieron cambios significativos en la apoptosis tarda cuadrante superior derechoa partir de la dosis 10 M. Cuando las clulas entran en apoptosis suele ocurrir una condensacin del DNA y posteriormente ste se fragmenta de forma controlada formando los llamados cuerpos apoptticos Robertson et al. Como vemos en la figura 22, al tratar las clulas con MET 10 M o JWH 10 M se próstata mcneal az cambios en la morfologa y tamao nuclear, existiendo mayor condensacin de La buena dieta cromatina, próstata mcneal az como ncleos de mayor tamao que en las clulas no tratadas con cannabinoides, pero no se lleg a detectar la presencia de cuerpos apoptticos, ni a las 48h ni a las 72 h de tratamiento.

Resultados 76 a vez conocido el próstata mcneal az de MET y JWH sobre las clulas PC-3, nos planteamos si ste sera generalizado sobre otras clulas tumorales de prstata.

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Se usaron otras dos lneas de cncer de prstata, la lnea celular andrgeno independiente DU y la andrgeno dependiente LNCaP. En la figura 23 vemos que ambos cannabinoides inhiben el crecimiento de todas próstata mcneal az lneas, pero el efecto es menos pronunciado en la lnea LNCaP, que representa un cncer de prstata menos agresivo.

Con ambos cannabinoides la disminucin de la viabilidad es ms acusada en las dos lneas ms agresivas, PC-3 y DU Las clulas fueron próstata mcneal az con 10 M de MET o JWH durante 48 h panel superior o 72 h panel inferiory transcurrido estos tiempos se tieron con DAPI tal y como se describe en Material y Mtodos y se observaron por microscopio de fluorescencia.

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